Genes em silêncio

Ferramenta molecular baseada na técnica de RNA de interferência pode auxiliar no combate a pragas agrícolas

O setor agrícola conta com uma nova ferramenta biotecnológica para combater pragas agrícolas, que causam grandes perdas às lavouras no mundo todo. As multinacionais norte-americanas Monsanto, recém-adquirida pela alemã Bayer, e DowDuPont obtiveram no ano passado aprovação para uso comercial nos Estados Unidos de uma semente transgênica feita com a técnica de silenciamento gênico por RNA (ácido ribonucleico) de interferência, ou simplesmente RNAi. Com efeito inseticida, ela foi criada para controlar a larva-alfinete americana (Diabrotica virgifera), fase larval de um besouro que é a principal ameaça às plantações de milho naquele país. É a primeira vez que moléculas de RNAi são usadas no combate a pragas do campo.



No Brasil, a empresa Tropical Melhoramento & Genética (TMG), com sede no Paraná e especializada em melhoramento genético de soja e algodão, espera dispor ainda este ano de uma molécula de RNAi para uso contra o percevejo-da-soja (Euschistus heros), importante praga da oleaginosa. O desenvolvimento da tecnologia está sendo feito por pesquisadores da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) também já criou um feijão transgênico com a técnica de RNAi, mas para controle de um vírus, conhecido como mosaico-dourado, que ataca esse plantio. Embora já aprovado desde 2011 pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), do Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações (MCTIC), o produto ainda não foi comercializado.

Criadas em laboratório, as moléculas de RNAi neutralizam a ação de um gene-alvo em um organismo qualquer – daí a expressão silenciamento gênico. Seu mecanismo de ação é similar ao que ocorre naturalmente em todos os seres vivos ao lutar contra ataques virais. Quando isso ocorre, as defesas do organismo tentam neutralizar a ação do invasor, silenciando seus genes. De modo análogo, a tecnologia de RNAi faz com que a célula ataque o produto de seu próprio gene, como se estivesse destruindo o material genético viral, num processo similar ao de uma resposta autoimune. No uso agrícola, o RNAi é programado para inativar genes específicos de pragas e patógenos associados a processos essenciais à sua sobrevivência.

A descoberta de que o processo de interferência por RNA poderia ser usado a favor do organismo humano rendeu aos pesquisadores Andrew Fire e Craig Mello, do Instituto Carnegie, de Washington, o prêmio Nobel de Medicina de 2006. O achado foi promissor porque revelou uma nova forma de assumir o comando celular, abrindo um amplo leque de aplicações. Desde então, a ferramenta é aplicada na pesquisa básica para estudo da função gênica e, na área da saúde, é vista como uma promessa para o tratamento de doenças genéticas (ver Pesquisa FAPESP nº 133).

Para entender como essa nova tecnologia funciona é preciso lembrar de processos da biologia celular, especificamente o mecanismo de expressão genética. Genes são segmentos da molécula de DNA que controlam as funções metabólicas das células, principalmente por meio da produção de proteínas. “Nossa informação genética está toda armazenada em nosso DNA. Para dar vida e uso a essa informação, o DNA deve, inicialmente, ser transcrito em RNA. Em seguida, esse RNA mensageiro é traduzido para proteínas. Esse é o processo básico de expressão gênica”, explica o biólogo Alexandre Garcia, gestor de pesquisa da TMG.



Como o nome deixa claro, a molécula sintética de RNAi interfere no processo de tradução do RNA mensageiro em proteína, fragmentando-o. Ela intercepta e destrói as informações celulares conduzidas pelo RNA dentro da célula antes que sejam processadas e originem proteínas. Dessa forma, o processo de expressão gênica que dependia dos dados contidos naquele RNA não irá mais ocorrer.

Milho pioneiro

O milho transgênico lançado pela Monsanto e DowDuPont foi batizado internamente de DvSnf7 e seu nome comercial é SmartStax. A sopa de letras é formada pelas iniciais da lagarta Diabrotica virgifera e o nome do gene-alvo, Snf7. Quando o inseto se alimenta da planta, a molécula de RNAi entra em seu organismo e silencia o gene Snf7, impedindo a produção de uma proteína que é vital para o funcionamento de tecidos da larva-alfinete americana. O resultado é a morte do inseto, conhecido como “o besouro de US$ 1 bilhão” por causa do enorme prejuízo causado aos agricultores norte-americanos. A química brasileira Renata Bolognesi integrou a equipe da Monsanto que criou o milho transgênico.

“A aplicação da tecnologia de RNAi na agricultura é bastante promissora”, destaca o engenheiro-agrônomo Henrique Marques-Souza, professor do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp e líder de um grupo de pesquisa nacional sobre silenciamento gênico. Ele se especializou no tema durante o doutorado na Universidade de Colônia, na Alemanha, concluído em 2007, e o pós-doutorado na Universidade da Califórnia, em Berkeley, Estados Unidos, realizado entre 2008 e 2010. De volta ao Brasil, passou a lecionar na Unicamp, onde criou o Brazilian Laboratory on Silencing Technologies (Blast) e derivou seus estudos sobre silenciamento gênico para a agricultura.

Em 2012, Marques-Souza e o engenheiro-agrônomo Antonio Vargas de Oliveira Figueira, do Centro de Energia Nuclear na Agricultura da Universidade
de São Paulo (Cena-USP), montaram um banco de sequências da traça-do-tomateiro (Tuta absoluta) e realizaram ensaios de silenciamento gênico para diversos genes do inseto. “Esse trabalho deu visibilidade ao nosso grupo. Hoje, podemos desenvolver a tecnologia de RNAi para virtualmente qualquer praga de qualquer cultura”, afirma o pesquisador da Unicamp. No ano passado, a técnica foi licenciada para a TMG pela Inova, a agência de inovação da Unicamp.


O maior desafio para a criação de um inseticida com RNAi para aplicação tópica é a reduzida estabilidade da molécula no ambiente

O primeiro produto a ser desenvolvido com a ferramenta pela empresa será destinado a controlar o percevejo-da-soja, uma das maiores ameaças à sojicultora nacional. “Esperamos ter definido até o fim do ano as melhores moléculas de RNA. Todo o trabalho será feito em caráter experimental e por meio de estudos controlados”, conta Garcia, da TMG, destacando que o caminho para essas moléculas se tornarem um produto comercial é longo e depende tanto da tecnologia usada para promover sua aplicação como do cenário de aprovações legais.

Segundo Marques-Souza, há duas formas de fazer com que as moléculas de RNAi entrem em contato com as pragas: pela criação de plantas transgênicas, como a Monsanto e a DowDuPont procederam com o milho DvSnf7, ou pelo desenvolvimento de produtos inseticidas. Essa é a escolha da TMG, que planeja criar um produto para aplicação tópica, como, por exemplo, um pulverizador. “Além de diminuir o tempo gasto para a produção de uma planta transgênica, o RNAi tópico pode ser considerado um produto natural, pois se trata de uma molécula biológica que não causa alterações genéticas na cultura de interesse ou no organismo desejado”, explica Marques-Souza.

A criação de um inseticida com RNAi, no entanto, não é trivial, e alguns obstáculos precisam ser superados. “Essas moléculas se degradam rapidamente no ambiente, o que dificulta a criação de um produto para aplicação na lavoura. Por isso, já existem investigações que buscam empregar recursos da nanotecnologia para proteger a molécula de RNAi [ver Pesquisa FAPESP nº 266] e elevar sua estabilidade”, destaca o biólogo Fernando Luís Cônsoli, do Departamento de Entomologia e Acarologia da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq) da USP, em Piracicaba, interior paulista.

O nanoencapsulamento de moléculas de RNAi é o tema do projeto de doutorado do biólogo Cyro von Zuben, aluno do IB-Unicamp orientado por Marques-Souza. Até o fim do ano deverão ser realizados ensaios com nanopartículas de argila, em conjunto com o Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), do governo paulista, e com o Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), para diversas espécies-alvos em estudo no laboratório Blast. Na Austrália, um grupo de pesquisa publicou há pouco tempo um artigo descrevendo o uso de nanopartículas que garantem a integridade e a entrega de RNAi por 30 dias.

Cônsoli também alerta que o processo de seleção de moléculas de RNAi deve considerar o risco de elas afetarem a própria planta ou organismos não alvo da tecnologia, inclusive o homem. De acordo com Marques-Souza, essa é uma preocupação real, mas que pode ser superada. “Quando se seleciona um gene-alvo para atingir o organismo de uma praga, devemos ter o cuidado de não escolher uma sequência gênica que seja complementar a um gene da planta ou de qualquer outro organismo que se alimente dela. Se este cuidado for tomado, o silenciamento gênico só ocorrerá no organismo-alvo”, diz. “A garantia de que o RNAi não terá nenhum efeito em humanos só virá com muito estudo.”

Alexandre Garcia reforça: “A tecnologia é baseada em sequências de RNA. Todos os seres vivos possuem sequências em comum, mas as espécies têm inúmeras sequências únicas que as diferenciam de outras espécies”. Hoje, com a quantidade de informações e bases de dados de genomas à disposição, é possível achar sequências que são exclusivas da espécie-alvo e desenhar moléculas que irão atuar apenas nessas sequências. “Dessa forma, todo o processo se torna específico e exclusivo para o organismo-alvo”, sustenta.

Norma da CTNBIO

Um passo importante para a regulamentação do uso do RNAi tópico no Brasil foi dado no início do ano quando a CTNBio publicou uma normativa definindo a tecnologia como um método que não envolve transgenia e classificando-a de Técnica Inovadora de Melhoramento de Precisão (Timp). Com isso, ela não estará necessariamente sujeita aos mesmos critérios de aprovação exigidos para organismos geneticamente modificados.

“O processo para gerar uma planta transgênica e passar por todos os mecanismos regulatórios globais para aprovar seu cultivo comercial é extremamente caro e demorado, podendo ultrapassar os US$ 100 milhões e 15 anos”, diz Garcia. “O uso da tecnologia de RNAi como produto de aplicação tópica, para o caso do percevejo-da-soja, é mais promissor. Essa tecnologia deverá estar à disposição dos agricultores brasileiros em alguns anos.”

Projeto

RNAi para controle de Tuta absoluta em tomateiro (nº 11/12869-6); Modalidade Auxílio à Pesquisa – Regular; Pesquisador responsável Antônio Vargas de Oliveira Figueira (USP); Investimento R$ 153.800,39.


Artigos científicos
PARTHASARATHY, R. et al. Physiological and cellular responses caused by RNAi-mediated suppression of Snf7 orthologue in western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) larvae. PLOS ONE. On-line. 18 jan. 2013.
CAMARGO, R. A. et al. RNA interference as a gene silencing tool to control Tuta absoluta in tomato (Solanum lycopersicum). PeerJ. On-line. 15 dez. 2016.

Autor: Revista Pesquisa Faperj
Fonte: Revista Pesquisa Faperj
Sítio Online da Publicação: Revista Pesquisa Faperj
Data de Publicação: 24/6/2018
Publicação Original: http://revistapesquisa.fapesp.br/2018/06/18/genes-em-silencio/

Estudo com gêmeos revela três genes relacionados a efeitos da zika em bebês

Tomografia de computador de dois pares de gêmos mostra a diferença do desenvolvimento dos cérebros devido à zika (Foto: Hug-Cell)

Estudando pares de gêmeos, cientistas conseguiram encontrar três genes que podem indicar uma maior suscetibilidade aos efeitos do vírus da zika nos bebês em gestação, causando malformações como a microcefalia.


Os resultados da pesquisa, liderada por Mayana Zatz e Maria Rita Passos-Bueno, da Universidade de São Paulo (USP) , foram publicados na revista "Nature Communications", nesta sexta-feira (2).


Jaqueline Jessica Silva de Oliveira é mãe de um dos casos estudados. Ela engravidou de gêmeos em 2015. Aos sete meses de gestação, descobriu que teria um dos bebês com microcefalia. Ela já tinha dois filhos, Paulo, com 9 anos, e Gabrielly, com 4. Há cerca de um ano, quando aceitou participar da pesquisa, ela contou ao G1 que teve os sintomas nos primeiros meses: dor de cabeça, manchas nos braços e mãos e coceira.

Casal de gêmeos Laura e Lucas: um tem microcefalia, o outro não (Foto: Arquivo Pessoal)

As duas crianças nasceram em 17 de novembro de 2015 e se chamam Laura e Lucas. Jaqueline disse que Mayana "a visitava toda a semana" para buscar informações. Hoje, as crianças têm mais de 2 anos.

"Não teve essa evolução que muitos esperavam ver. Ela [Laura] está bem, do jeitinho que ela é. Mas evolução de sentar, de andar, de falar não teve", disse. "O outro [Lucas] se desenvolveu normalmente: ele fala, ele anda", completou.

Nove pares

Para detectar a propensão genética à síndrome congênita de zika -- nome dado às malformações causadas pelo vírus aos bebês em gestação, inclundo a microcefalia --, as pesquisadoras compararam nove pares de gêmeos.


Dois pares eram gêmeos idênticos, ambos com sequelas do vírus; um par não era idêntico, mas também tinha sido afetado; e seis pares eram não idênticos em que uma criança era afetada, e a outra não.

Elas coletaram amostras de sangue e saliva das crianças.

"Não achamos nenhum gene principal. Concluímos que é uma herança complexa. Vou te dar um exemplo: risco para diabetes. A gente sabe que há um componente genético de aumento do risco para a diabetes, mas não existe só um gene principal", disse Mayana.

A pesquisadora explica que, como concluíram que não havia um gene principal, foram para uma segunda saída. "Estudamos o RNA, que é a expressão dos genes", disse. Ou seja, elas passaram a investigar quais são eram os genes cuja ação era silenciada ou ativada para agir em determinadas células.

O RNA de três pares de gêmeos bivitelinos (não idênticos) foi analisado, entre eles, os de Laura e Lucas. As pesquisadoras conseguiram encontrar uma característica genética em comum nos três bebês que apresentaram microcefalia. Diferentemente de seus irmãos, todos eles tiveram uma alteração no gene DDIT4L.

As pesquisadoras notaram que ele estava muito menos expresso nas células afetadas e isso causou uma mudança com relação à proteína mTor, envolvida no crescimento e na morte celular. Outros estudos já haviam relacionado a mTor à replicação do vírus da zika.

Alterações nos genes identificados como FOXG1 e LHX2 também foram encontradas. Eles atuam no processo de desenvolvimento de áreas cerebrais durante o crescimento. O primeiro deles também é associado a distúrbios cerebrais congênitos.

"Demonstramos que existe um componente genético de suscetibilidade, que não é ao acaso, e a partir daí estamos aprofundando o estudo para tentar entender porque o vírus prefere algumas células no lugar de outras", afirmou Mayana.

Os gêmeos bivitelinos (gerados a partir de dois óvulos e dois espermatozoides diferentes) foram fundamentais para os resultados do estudo, porque estiveram expostos às mesmas condições no ambiente: filhos da mesma mãe, entraram em contato com o zika na mesma época. Mesmo assim, o vírus afetou o cérebro de apenas um dos irmãos.


Autor: Carolina Dantas
Fonte: G1
Sítio Online da Publicação: G1
Data de Publicação: 02/02/2018
Publicação Original: https://g1.globo.com/bemestar/zika-virus/noticia/estudo-com-gemeos-revela-tres-genes-relacionados-a-efeitos-da-zika-em-bebes.ghtml

Análise de trechos de DNA que contêm os genes aprofunda o diagnóstico de doenças

Em março deste ano, em uma das salas do ambulatório do quinto andar do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FM-USP), o endocrinologista Alexander Jorge atendeu um casal para apresentar a provável causa da microcefalia e da baixa estatura da filha de 4 anos. Não era a infecção da mãe com sífilis durante a gravidez, como se cogitara inicialmente, mas uma mutação em um gene de reparo do DNA conhecido como BRCA1. O médico explicou que essa mutação, identificada na filha em homozigose (duas cópias) e nos pais em heterozigose (uma cópia), favorecia o desenvolvimento de tumores de mama e ovários. Em seguida, a mulher de 32 anos comentou: “Doutor, tenho um caroço na axila”. Era um sinal de que ela própria poderia ter um câncer de mama não diagnosticado e já em expansão. Diante da situação, Jorge encaminhou a mãe de sua paciente para a equipe de oncologia, no prédio ao lado, para fazer o diagnóstico.

Jorge tem vivido situações desse tipo com frequência desde 2013, quando começou a usar uma técnica que faz o sequenciamento completo de conjuntos de trechos do DNA conhecidos como éxons, que representam de 1% a 2% do material genético. É no exoma, o conjunto dos éxons, que estão os 19 mil genes humanos, cujas mutações podem causar doenças. O sequenciamento de todo o material genético (genoma) raramente é feito para finalidades médicas, por ser mais caro e dar informações sobre trechos do DNA chamados íntrons, raramente associados a doenças.

Nos últimos anos, o sequenciamento completo de exoma se sobrepôs à abordagem anterior, que lia poucos éxons de cada vez, e tem se mostrado eficaz para identificar a mutação responsável por 8.500 doenças genéticas provocadas por um único gene em até 40% das pessoas examinadas. “A taxa de sucesso pode chegar a 80% quando já existem genes candidatos previamente selecionados para explicar o quadro clínico”, assegura Jorge.

O custo para sequenciar o exoma ainda é alto – no Brasil, pode chegar a R$ 10 mil. Outra dificuldade é que o sequenciamento fornece uma quantidade monumental de informação porque qualquer pessoa apresenta cerca de 50 mil mutações, a maioria inócuas. As análises exigem equipes especializadas de biólogos, bioinformatas e médicos para se chegar às 20 ou 30 alterações mais relevantes, que debilitam a função original dos genes e poderiam explicar os sintomas de uma doença.

Apesar das limitações, essa técnica tem ajudado a solucionar diagnósticos incertos e a direcionar tratamentos. Depois de identificar a mutação no gene BRCA1, que poderia explicar a microcefalia e a baixa estatura da menina, com o apoio de relatos semelhantes em outros países, Jorge concluiu que não deveria adotar o tratamento tradicional para baixa estatura, com hormônio de crescimento, que poderia aumentar o risco de câncer.

O sequenciamento de exoma está trazendo uma nova forma de trabalho, mais aberta e colaborativa, para pesquisadores e clínicos. Em setembro de 2016, Jorge não tinha como confirmar se uma mutação no gene BCL11B seria responsável pela deficiência intelectual, defeito na arcada dentária e baixa estatura de um adolescente. Ele entrou no site GeneMatcher, que compartilha informações sobre mutações genéticas e suas possíveis consequências com médicos, pesquisadores e pacientes. Seu relato chamou a atenção de pesquisadores da Alemanha e dos Estados Unidos que tinham casos semelhantes, associados àquela mutação, e lhe permitiu fechar o diagnóstico e reunir informações sobre uma nova doença que poderiam facilitar o trabalho de outros médicos.

“Quanto mais detalhadas as descrições dos quadros clínicos dos pacientes e das famílias, com hipóteses diagnósticas consistentes, maior a chance de fazer uma interpretação correta do exoma”, diz a bióloga Maria Rita Passos Bueno, uma das coordenadoras do Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco (CEGH-CEL) do Instituto de Biociências da USP. Em geral os médicos, os centros de pesquisa e os laboratórios responsáveis pelos diagnósticos trabalham de modo isolado, mas a integração de equipes, a troca de informações e a harmonização de procedimentos técnicos e éticos poderiam beneficiar os pacientes, os pesquisadores e as equipes médicas, segundo estudo de um grupo do Instituto Nacional do Câncer da Holanda publicado em maio na revista Annals of Oncology.


© LÉO RAMOS CHAVES

Na Faculdade de Medicina da USP, a bióloga Amanda Narcizo…

Um gene, várias doenças
As análises do exoma estão indicando que doenças antes vistas como distintas poderiam ter a mesma origem genética. A equipe da Mendelics, uma das empresas de São Paulo especializada em análises genéticas, em atuação desde 2013, verificou que o gene TRPV4poderia causar tanto doenças musculares quanto ósseas. Em seu doutorado na Universidade Estadual Paulista (Unesp), sob a orientação da bióloga Silvia Rogatto, a também bióloga Maísa Pinheiro identificou uma alteração em um gene de reparo de DNA – a ser apresentada em um artigo submetido para publicação – como possível causa do câncer de mama e do de tireoide. Maísa identificou a mutação em pacientes tratados no A.C.Camargo Cancer Center, em São Paulo, que tinham um dos dois ou os dois tipos de câncer, além de familiares atingidos por esses tumores. “O câncer de mama e o de tireoide poderiam integrar uma síndrome de predisposição hereditária”, sugere Silvia, atualmente na Universidade do Sul da Dinamarca, em Odense.

O sequenciamento de exoma tem sido cada vez mais usado por grupos de pesquisa em São Paulo, Belo Horizonte, Porto Alegre, Recife, Brasília e outras cidades para descobrir as causas de tumores, de doenças esqueléticas, musculares, neurológicas e outras, de origem genética. Um grupo do Baylor College of Medicine, dos Estados Unidos, fez o sequenciamento de exoma de 2 mil pacientes, a maioria crianças, com suspeita não confirmada de doenças genéticas associadas ao atraso de desenvolvimento neurológico. Todos tinham passado por testes bioquímicos de sangue, que não definiram a causa das doenças. Como relatado em um artigo de 2014 no Journal of the American Medical Association, as mutações reveladas pelo sequenciamento de exoma elucidaram a causa das doenças de 504 pacientes e permitiram planejar o tratamento e o aconselhamento genético familiar.

O CEGH-CEL atende famílias com doenças genéticas desde 1968, trabalha com sequenciamento de exoma desde 2012 e identificou novas mutações causadoras de autismo, doenças musculares, doenças esqueléticas, deficiência intelectual, obesidade e surdez. Em setembro, o laboratório de testes genéticos do centro deve começar a oferecer o miniexoma, a um custo aproximado de R$ 4 mil, para procurar mutações em até 6.709 genes já associados a doenças genéticas, em vez de examinar todos os 19 mil genes. A redução de preço pode aumentar o uso dessa técnica no sistema de saúde brasileiro.

O médico e bioinformata Guilherme Yamamoto, que trabalha no Instituto da Criança do Hospital das Clínicas e no CEGH-CEL, avaliou a eficácia do miniexoma para detectar mutações em 500 genes responsáveis por um grupo de 26 doenças genéticas de recém-nascidos com ênfase em erros inatos do metabolismo. Usando essa estratégia de sequenciamento focado de genes, ele refez os testes genéticos de 90 pessoas: 45 crianças atendidas no Hospital das Clínicas de Porto Alegre e 45 controles. Sem conhecer o diagnóstico prévio, Yamamoto encontrou um resultado falso-positivo e um verdadeiro-positivo no grupo dos 45 que inicialmente não apresentavam doença genética. No outro grupo, ele identificou a doença genética adequadamente em 22 das 45 crianças. O teste apresentou uma sensibilidade total de 50% e de 73% no grupo de erros inatos do metabolismo, embora não tenha detectado os casos de distrofia muscular, epilepsia e imunodeficiência.

“A triagem por teste genético tem uma alta especificidade, com apenas um falso-positivo”, argumentou Yamamoto. Segundo ele, essa abordagem poderia complementar a triagem neonatal, mais conhecida como teste do pezinho, que detecta doenças genéticas, metabólicas e infecciosas. “O teste do pezinho apresenta baixa especificidade, com alta frequência de falso-positivos, para algumas doenças examinadas”, diz. Segundo ele, o ganho de precisão no reconhecimento das doenças genéticas de recém-nascidos poderia adiantar o início do tratamento.

“O sequenciamento de exoma funciona bem para identificar erros inatos de metabolismo”, concorda o neurologista Fernando Kok, professor da FM-USP e diretor médico da Mendelics. Sua empresa pretende lançar neste ano um teste para identificar mutações em 260 genes responsáveis por 150 doenças genéticas em recém-nascidos.


© LÉO RAMOS CHAVES

…prepara uma placa com 96 microtubos (detalhe acima) para fragmentação acústica de trechos de DNA, etapa inicial do sequenciamento de exomas

Reanálises
Na Mendelics, biólogos, geneticistas, médicos recebem os resultados organizados por meio de um programa de computador chamado Abracadabra, desenvolvido pelo grupo liderado pelo neurologista David Schlesinger, presidente da empresa, destacado em 2014 pela MIT Technology Reviewcomo um dos 10 pesquisadores com menos de 35 anos mais inovadores do Brasil (ver Pesquisa FAPESP nº 220). O Abracadabra filtra as mutações por grupos de doença, indicando as prejudiciais e eliminando os achados incidentais em genes de menor interesse, e procura automaticamente relatos semelhantes em bases de dados on-line.

Outro programa da equipe do bioinformata João Paulo Kitajima, da Mendelics, começou a ser testado em agosto para identificar genes que escapam das análises normais de exoma. Esses genes têm uma peculiaridade: não toleram a perda de função de uma de suas cópias – são os chamados constraints. Com essa estratégia, espera-se resolver casos não solucionados. Em dois dias de trabalho, a médica geneticista Luiza Ramos encontrou uma alteração genética que poderia explicar um dos primeiros 52 casos não solucionados examinados por meio do novo programa. Em frente a outro computador da mesma sala, a médica geneticista Fabíola Monteiro comentou que as análises de exomas estão ampliando o conhecimento sobre genética, ao revelar muitas formas e muitas causas para as mesmas doenças. “O que está escrito nos livros de genética”, diz ela, “é muito pouco, diante do que estamos vendo”.

Para entender os resultados

Na Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), um grupo coordenado pela médica geneticista Iscia Lopes Cendes atualmente desenvolve programas de computador para facilitar a interpretação dos resultados do sequenciamento de exomas, que pode ser útil na busca pela causa de doenças provocadas por apenas um gene. Esses programas também integram essas informações com as disponíveis em bases de dados como a Iniciativa Brasileira em Medicina de Precisão (BIPMed), com informação genética específica da população brasileira. Os primeiros programas devem ser liberados para uso público ainda neste ano, conta Iscia, que é professora da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp e pesquisadora do Instituto Brasileiro de Neurociência e Neurotecnologia (Brainn), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (Cepid) financiados pela FAPESP.

Além de buscar novas estratégias para avaliar o sequenciamento de exomas, o grupo de Iscia também investiga a relação entre o custo e o benefício de se incorporar esse exame ao sistema público de saúde. Em um estudo em fase final de desenvolvimento com 150 pacientes, a médica geneticista Joana Trotta verificou que o exoma poderia indicar a provável causa de 80% de doenças neurodegenerativas com início na vida adulta, como ataxia e demência, nem sempre detectadas mesmo após sucessivos exames de imagem. A proporção de diagnósticos positivos para a deficiência intelectual foi de 20%, 10 vezes mais elevada do que a obtida pela técnica adotada no serviço público de saúde, que consiste no exame de cromossomos (cariótipo). “Aumentando a proporção de diagnósticos corretos sobre a origem das doenças, os gastos com outros exames e consultas caem e o tratamento, quando possível, pode começar logo”, conta Iscia.

Projetos
1. Novas abordagens e metodologias na investigação genético-molecular dos distúrbios de crescimento e desenvolvimento puberal (nº 13/03236-5); Modalidade Projeto Temático; Pesquisador responsável Alexander Augusto de Lima Jorge (USP); Investimento R$ 2.948.891,06.
2. CEGH-CEL – Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e de Células-Tronco (nº 13/08028-1); Modalidade Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão (Cepid); Pesquisadora responsável Mayana Zatz (USP); Investimento R$ 27.221.413,39 (para todo o projeto).






Artigos científicos
VIS, D. J. et al. Towards a global cancer knowledge network: Dissecting the current international cancer genomic sequencing landscape. Annals of Oncology. v. 28, n. 5, p. 1145-51. 2017.
YANG, Y. et al. Molecular findings among patients referred for clinical whole-exome sequencing. JAMA. v. 312, n. 18, p. 1870-79. 2014.




Autor: CARLOS FIORAVANTI | ED. 259 |
Fonte: fapesp
Sítio Online da Publicação: fapesp
Data de Publicação: SETEMBRO 2017
Publicação Original: http://revistapesquisa.fapesp.br/2017/09/22/mergulho-nas-doencas-geneticas/?cat=ciencia

Grupo da USP identifica genes ligados à progressão do melanoma

Mapeamento foi feito usando um composto sintético similar à curcumina, que em testes preliminares apresentou ação antitumoral – Foto: Skincareaus/Wikimedia Commons

Ao tratar linhagens celulares de melanoma humano com um composto sintético semelhante à curcumina – pigmento que dá a cor amarelo-alaranjada ao pó extraído da raiz da cúrcuma (Curcuma longa) – pesquisadores da USP identificaram genes que estão com a expressão alterada em tumores com potencial invasivo e em células malignas refratárias à quimioterapia.

Segundo os cientistas, caso novos estudos confirmem a importância desses genes para a progressão da doença e o ganho de resistência aos medicamentos, eles poderão ser explorados no futuro como biomarcadores para auxílio do diagnóstico ou até mesmo como alvos terapêuticos. Resultados da pesquisa, apoiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), foram publicados na revista Pharmacological Research.

“Estudos anteriores de colaboradores já haviam demonstrado que o DM-1, composto análogo à curcumina, tem atividade antitumoral em baixas concentrações. Nosso objetivo foi entender quais genes essa substância modula e por que ela é tóxica para o melanoma e não para uma célula normal”, disse Érica Aparecida de Oliveira, pós-doutoranda na Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) da USP.

A pesquisa vem sendo desenvolvida sob a supervisão de Silvya Stuchi Maria-Engler, com a colaboração de Helder Nakaya e Gisele Monteiro – todos professores da FCF.

Como explicou Érica Oliveira, a literatura científica conta com algumas centenas de trabalhos atestando as propriedades antioxidantes, antitumorais, antimicrobianas e anti-inflamatórias da curcumina. No entanto, o uso terapêutico desse composto na forma natural é limitado devido à sua má absorção, metabolismo rápido e insolubilidade na água. Para resolver esse problema, cientistas têm desenvolvido análogos sintéticos com pequenas modificações estruturais que visam a tornar a molécula mais estável no organismo.

O DM-1 foi sintetizado há alguns anos pelo professor José Agustín Pablo Quincoces Suárez, da Universidade Bandeirantes (Uniban). “Experimentos com animais feitos por colaboradores mostraram que o tratamento com esse composto é capaz de promover uma redução no volume tumoral. O DM-1 também se mostrou tóxico para culturas de melanoma resistentes à quimioterapia”, conta Érica.
Mecanismo de ação

Para desvendar os mecanismos de ação do DM-1, Érica recorreu a uma plataforma desenvolvida pelo grupo de Monteiro. Trata-se de uma coleção de 6 mil leveduras congeladas, todas mutantes da espécie Saccharomyces cerevisiae, comumente usada na fermentação de pão e cerveja.

“O genoma dessa levedura tem 6 mil genes e, em cada um desses mutantes, um gene diferente foi silenciado. Com isso, pudemos estudar o efeito de um composto de forma muito específica, gene a gene”, explica Érica.

As 6 mil levaduras mutantes foram então descongeladas, distribuídas em placas contendo 96 pequenos poços e tratadas com DM-1. Ao isolar as leveduras que não cresceram na presença do análogo de curcumina, Érica obteve uma primeira lista com 211 genes afetados pelo tratamento.

Embora seja a forma mais rara de câncer de pele (cerca de 4% dos casos), o melanoma é a mais letal – Foto: Pixabay / CC0

O passo seguinte foi filtrar quais genes dessa lista apresentam homólogos no genoma humano, pois parte poderia estar relacionada a funções específicas de leveduras. Com auxílio de ferramentas de bioinformática e da expertise de Nakaya, o grupo chegou a uma segunda lista com 79 genes candidatos.

“Começamos então a olhar os bancos públicos que armazenam dados genômicos de pacientes com câncer, como o The Cancer Genome Atlas (TCGA) e o Gene Expression Omnibus (GEO), para entender de que forma esses genes conversavam entre si”, contou Érica.

A análise mostrou que a maioria estava relacionada a vias de sinalização celular que, quando ativas, favorecem a progressão tumoral. É o caso das vias mediadas pelas proteínas MAP quinase e EGFR.

A tarefa seguinte foi investigar quais genes eram importantes para o avanço do melanoma especificamente – focando as análises de bioinformática nas sequências genômicas de portadores da doença.

“Fizemos uma mineração nos dados para mapear genes cuja expressão se alterava durante a progressão do melanoma. Identificamos sete que pareciam ser importantes e, ao olhar os bancos de dados públicos, pudemos ver que de fato muitos pacientes tinham alteração na expressão desses genes”, conta Érica.
Novo foco

Em um segundo projeto de pós-doutorado atualmente em andamento, com apoio da Fapesp, Érica pretende investigar mais profundamente a participação do gene TOP-1 e também do ATP6V0B – um dos sete identificados no trabalho anterior – na progressão do melanoma.

“Estamos investigando como esses genes estão expressos em um amplo painel de melanomas: tumores primários, metastáticos, com e sem mutação no gene BRAF, resistentes ou não ao tratamento. E também pretendemos comparar com a expressão em um melanócito normal. O objetivo é entender como esses genes participam da progressão tumoral e o que acontece em cada caso quando eles são inibidos”, diz.

Embora seja a forma mais rara de câncer de pele (cerca de 4% dos casos), o melanoma é sem dúvida a mais letal. A doença se desenvolve a partir dos melanócitos, as células produtoras de melanina. Além do crescimento rápido e do alto potencial para se tornar invasivo e gerar metástase, esse tipo de tumor desenvolve frequentemente resistência às principais drogas usadas no tratamento.

“A existência de diferentes subpopulações celulares dentro de um mesmo tumor é hoje considerado o principal fator associado à resistência ao tratamento. Por isso, acredita-se que a melhor abordagem é a combinação de várias estratégias terapêuticas e, para isso, é importante a descoberta de novos alvos”, afirma Érica.

O artigo Toxicogenomic and bioinformatics platforms to identify key molecular mechanisms of a curcumin-analogue DM-1 toxicity in melanoma cells pode ser lido neste link.

Adaptado de Karina Toledo / Agência Fapesp, com edição do Jornal da USP (Leia aqui o texto original)

Autora: Jornal USP
Fonte: Jornal USP
Sítio Online da Publicação: Jornal USP
Data de Publicação: 23/11/2017
Publicação Original: http://jornal.usp.br/ciencias/ciencias-da-saude/grupo-da-usp-identifica-genes-ligados-a-progressao-do-melanoma/

Grupo da USP identifica genes relacionados à progressão do melanoma

Ao tratar linhagens celulares de melanoma humano com um composto sintético semelhante à curcumina – pigmento que dá a cor amarelo-alaranjada ao pó extraído da raiz da cúrcuma (Curcuma longa) – pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP) identificaram genes que estão com a expressão alterada em tumores com potencial invasivo e em células malignas refratárias à quimioterapia.


Mapeamento foi feito usando um composto sintético similar à curcumina, que apresentou em testes preliminares ação antitumoral (foto: Skincareaus / Wikimedia)

Segundo os cientistas, caso novos estudos confirmem a importância desses genes para a progressão da doença e o ganho de resistência aos medicamentos, eles poderão ser explorados no futuro como biomarcadores para auxílio do diagnóstico ou até mesmo como alvos terapêuticos.

Resultados da pesquisa, apoiada pela FAPESP foram publicados na revista Pharmacological Research.

“Estudos anteriores de colaboradores já haviam demonstrado que o DM-1, composto análogo à curcumina, tem atividade antitumoral em baixas concentrações. Nosso objetivo foi entender quais genes essa substância modula e por que ela é tóxica para o melanoma e não para uma célula normal”, disse Érica Aparecida de Oliveira, pós-doutoranda na Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) da USP.

A pesquisa vem sendo desenvolvida sob a supervisão de Silvya Stuchi Maria-Engler, com a colaboração de Helder Nakaya e Gisele Monteiro – todos professores da FCF-USP.

Como explicou Oliveira, a literatura científica conta com algumas centenas de trabalhos atestando as propriedades antioxidantes, antitumorais, antimicrobianas e anti-inflamatórias da curcumina. No entanto, o uso terapêutico desse composto na forma natural é limitado devido à sua má absorção, metabolismo rápido e insolubilidade na água. Para resolver esse problema, cientistas têm desenvolvido análogos sintéticos com pequenas modificações estruturais que visam tornar a molécula mais estável no organismo.

O DM-1 – cujo nome completo é sodium 4-[5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-oxo- penta-1,4-dienyl]-2-methoxy-phenolate – foi sintetizado há alguns anos pelo professor José Agustín Pablo Quincoces Suárez, da Universidade Bandeirantes (Uniban).

“Experimentos com animais feitos por colaboradores mostraram que o tratamento com esse composto é capaz de promover uma redução no volume tumoral. O DM-1 também se mostrou tóxico para culturas de melanoma resistentes à quimioterapia”, contou Oliveira.

Mecanismo de ação

Para desvendar os mecanismos de ação do DM-1, Oliveira recorreu a uma plataforma de toxicogenômica desenvolvida pelo grupo de Monteiro. Trata-se de uma coleção de 6 mil leveduras congeladas, todas mutantes da espécie Saccharomyces cerevisiae, comumente usada na fermentação de pão e cerveja.

“O genoma dessa levedura tem 6 mil genes e, em cada um desses mutantes, um gene diferente foi silenciado. Com isso, pudemos estudar o efeito de um composto de forma muito específica, gene a gene”, explicou Oliveira.

As 6 mil levaduras mutantes foram então descongeladas, distribuídas em placas contendo 96 pequenos poços e tratadas com DM-1. Ao isolar as leveduras que não cresceram na presença do análogo de curcumina, Oliveira obteve uma primeira lista com 211 genes afetados pelo tratamento.

O passo seguinte foi filtrar quais genes dessa lista apresentam homólogos no genoma humano, pois parte poderia estar relacionada a funções específicas de leveduras. Com auxílio de ferramentas de bioinformática e da expertise de Nakaya, o grupo chegou a uma segunda lista com 79 genes candidatos.

“Começamos então a olhar os bancos públicos que armazenam dados genômicos de pacientes com câncer, como o The Cancer Genome Atlas (TCGA) e o Gene Expression Omnibus (GEO), para entender de que forma esses genes conversavam entre si”, contou Oliveira.

A análise mostrou que a maioria estava relacionada a vias de sinalização celular que, quando ativas, favorecem a progressão tumoral. É o caso das vias mediadas pelas proteínas MAP quinase e EGFR.

A tarefa seguinte foi investigar quais genes eram importantes para o avanço do melanoma especificamente – focando as análises de bioinformática nas sequências genômicas de portadores da doença.

“Fizemos uma mineração nos dados para mapear genes cuja expressão se alterava durante a progressão do melanoma. Identificamos sete que pareciam ser importantes e, ao olhar os bancos de dados públicos, pudemos ver que de fato muitos pacientes tinham alteração na expressão desses genes”, contou Oliveira.

Em testes in vitro, com uma linhagem de melanoma parental (não resistente ao tratamento), a pesquisadora observou que o tratamento com DM-1 induz a morte celular principalmente por aumentar a expressão de um gene conhecido como TOP-1. Quando ativo, esse gene induz erros na transcrição do DNA e, portanto, causa instabilidade genômica na célula.

Já na linhagem de melanoma resistente, a citotoxicidade foi causada principalmente pelo aumento na expressão do gene ADK, envolvido na produção de energia para a célula.

“Assim como a curcumina, que é uma molécula capaz de interagir com múltiplos alvos celulares e modular múltiplas vias de sinalização, o DM-1 também age em vias diferentes para promover a toxicidade tanto no melanoma parental como no resistente”, avaliou Oliveira.

Novo foco

Em um segundo projeto de pós-doutorado atualmente em andamento, com apoio da FAPESP, Oliveira pretende investigar mais profundamente a participação do gene TOP-1 e também do ATP6V0B – um dos sete identificados no trabalho anterior – na progressão do melanoma.

“Estamos investigando como esses genes estão expressos em um amplo painel de melanomas: tumores primários, metastáticos, com e sem mutação no gene BRAF, resistentes ou não ao tratamento. E também pretendemos comparar com a expressão em um melanócito normal. O objetivo é entender como esses genes participam da progressão tumoral e o que acontece em cada caso quando eles são inibidos”, disse.

Embora seja a forma mais rara de câncer de pele (cerca de 4% dos casos), o melanoma é sem dúvida a mais letal. A doença se desenvolve a partir dos melanócitos, as células produtoras de melanina. Além do crescimento rápido e do alto potencial para se tornar invasivo e gerar metástase, esse tipo de tumor desenvolve frequentemente resistência às principais drogas usadas no tratamento.

“A existência de diferentes subpopulações celulares dentro de um mesmo tumor é hoje considerado o principal fator associado à resistência ao tratamento. Por isso, acredita-se que a melhor abordagem é a combinação de várias estratégias terapêuticas e, para isso, é importante a descoberta de novos alvos”, disse Oliveira.

O artigo Toxicogenomic and bioinformatics platforms to identify key molecular mechanisms of a curcumin-analogue DM-1 toxicity in melanoma cells (https://doi.org/10.1016/j.phrs.2017.08.018) pode ser lido emwww.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661817305662.

Autora: Karina Toledo
Fonte: Agência FAPESP
Sítio Online da Publicação: FAPESP
Data de Publicação: 16/11/2017
Publicação Original: http://agencia.fapesp.br/grupo_da_usp_identifica_genes_relacionados_a_progressao_do_melanoma/26653/